细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)作为亲代细胞的“指纹”，能够实时揭示亲代细胞的代谢、增殖、迁移等信息，为癌症检测中的早期诊断、分型、预后、伴随诊断、动态监测等提供有力工具。这篇综述概括了目前从体液中分离EVs的方法以及分析EVs中生物标志物分子(包括蛋白质、核酸和脂质等)的技术进展，并讨论了基于EVs的体外诊断在临床应用中的优势、可行性和面临的挑战。
EVs是细胞释放的各种具有脂质双层膜结构的囊泡总称，主要由外泌体、微囊泡和凋亡小体组成，EV在血浆和其他体液中含量丰富并且可以稳定存在，携带来源细胞的蛋白质、核酸等重要生物分子，成为液体活检的理想生物标志物。然而EVs的尺寸只有几十纳米到几百纳米，而且异质性强，仅仅依靠单一技术分析其浓度、尺寸、力学性质等物理化学性质以及蛋白质、核酸等生物分子的表达量、组成、二级结构等信息都非常困难。近期，国家纳米科学中心杨延莲研究员、朱凌研究员和王琛研究员在期刊VIEW上发表了综述文章“In vitro diagnostic technologies for the detection of extracellular vesicles: current status and future directions”，总结了目前从体液中分离富集EVs的方法和分析EVs生物大分子的技术，并对这些技术的难点以及临床应用的可行性和挑战性进行了深入的讨论。本文的第一作者为国家纳米科学中心中丹中心研究生宋书雅。
随着EVs检测技术的发展，多种EVs来源的蛋白质和miRNA等生物标志物被发现，在肿瘤、神经退行性疾病、心脑血管疾病、免疫系统疾病等诸多疾病中显示出良好的辅助诊断效能。目前，基于EV的临床诊断技术的开发也大多聚焦于不同亚群特异性内容物的检测，主要包括核酸、蛋白质，以及以脂质为代表的代谢分子三大领域。
传统的免疫分析方法，如免疫印迹法、 酶联免疫吸附测定、化学发光、电化学发光、流式细胞术等可对EVs的膜蛋白或者蛋白质类内容物进行定性和/或定量检测，质谱技术也可以通过直接测量对特定的蛋白质进行定性/定量，而且可以通过蛋白质组学研究获得更丰富的生物信息。近年来，传统流式细胞术的改进和纳米级流式细胞仪的出现，大大提高了仪器的检测性能，使单个EVs水平的多参数分析成为可能。
另外将EVs的分离和检测功能集成一体的微流控芯片上可改善部分传统方法的缺点, 只需更少量的样品、操作简便、快捷省时，在临床诊断中有巨大的应用潜力。然而对于临床应用而言，EV检测技术的先进性以及独一无二并不是最重要的，检测灵敏度和特异性，工艺和分析性能的稳定性、可靠性以及临床价值的关联才是最重要的。目前基于流式细胞术、磁微粒化学发光法、电化学发光等的EV体外诊断技术已经逐渐成熟并走向临床应用。
EVs的核酸包括不同形式的RNA (mRNA、miRNA和非编码RNA)和DNA。目前大多数研究集中在RNA上。针对RNA类内容物，传统的检测技术包括琼脂糖凝胶电泳、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、二代测序技术（NGS）等。EVs的RNA内容物新型检测平台已经引入了实时定量PCR（RT-PCR）、数字PCR（dPCR）、数字微滴PCR（ddPCR）荧光探针、局域表面等离激元共振等技术。目前基于NGS、RT-PCT、dPCR、ddPCR等平台的分子诊断技术比较成熟，在捕获外泌体之后进行核酸的突变检测是癌症诊断的可行方案。目前美国Exosome Diagnostics公司已经推出了外泌体EML-4-ALK突变进行非小细胞肺癌（NSCLC）诊断的产品，以及通过检测尿液中的外泌体RNA进行前列腺癌诊断的产品，并且后者已经获得FDA批准，这标志着基于EV的体外诊断技术成为液体活检领域的重要赛道。
除蛋白质与核酸外，EVs中还含有以脂质为代表的一系列代谢分子，包括胆固醇、神经酰胺、磷脂酰丝氨酸等。目前，针对脂质的检测方法相对较少，主要为脂质组学和代谢组学方法，如全反射傅里叶变换红外光谱、高效液相色谱、高通量质谱和拉曼光谱等。不过这些方法都还停留在实验室阶段，走向临床应用还有一段距离。
此外，基本的机器学习算法是强大的应用智能工具，机器学习可以实现EVs生物标志物的多组分分析，结合EVs检测技术和机器学习算法可以增加诊断准确性。
尽管EV检测和诊断方面取得了巨大的进步，但从实验室层面的EV生物标志物的差异表达检测到全面的以及EV检测的临床诊断仍然具有巨大的挑战。首先，缺乏标准化提取以及EV测试技术的；第二，EV检测结果的重现性仍然值得商榷，而且很难横向比较不同检测平台的测试结果，而且检测的溯源链仍然缺乏；第三，距离统一的临床参考区间仍然。总体而言，尽管仍然有很多挑战性难题，EV的诊断有巨大的临床价值，所以通过分子生物学、物理化学、工程学和医学等多学科协作，基于EV的体外诊断技术必将成为有巨大临床价值和商业价值的液体活检技术。
